Описание

Mirrorball – это новое поколение лазерных цитометров для сканирования планшет с образцами, они позволяют проводить широкий спектр исследований как с флуоресцентно-меченными клетками, так и с использованием микросфер (beads): 

• скрининг биологических объектов (гибридомы, фаговый дисплей, клонирование B-клеток)
• характеристика параметров связывания (определение Bmax и Kd, конкурентный анализ, изотипирование)
• функциональный анализ (гибель клеток, клеточный цикл, пролиферация, передача внутриклеточных сигналов)
• определение растворимых белков (цитокинов, гормонов, факторов роста)

Mirrorball позволяет проводить лазерное сканирование и детекцию до 5 флуоресцентных красителей одновременно. Высокая чувствительность, мультиплексность, простота и скорость проведения исследований, а также возможность автоматизации пробоподготовки делает mirorball уникальной системой для клеточного скрининга. 

Простой протокол анализа «смешай и считывай» существенно упрощает исследования по разработке антител и скрининг клеточных препаратов, исключая трудозатратные стадии промывки на этапе пробоподготовки. 

Mirrorball – это новое поколение лазерных цитометров, сканирующих планшеты с образцами и позволяющих проводить широкий круг исследований как с флуоресцентно-меченными клетками, так и с использованием микросфер (beads). 

• Одновременная детекция: от 1 до 5 красителей
• Фон убирается благодаря узкой глубине захвата изображения
• Многопараметрические данные по отдельным клеткам или микросферам (beads) 
• Всего 12 минут на сканирование и анализ планшеты любого формата - 96, 384 and 1536-луночных 
• Изображение как визуальное подтверждение результатов 
• Отсутствие проточных каналов, ежедневного ухода, нет рисков забивания каналов, низкая стоимость владения 
• Оптимально как для адгезивных, так и для суспензионных клеточных линий

 

Особенности

Уникальные возможности мультиплексной детекции

Mirrorball первый микропланшетный цитометр, позволяющий одновременно проводить лазерное сканирование и детекцию до 5 флуоресцентных красителей. Это позволяет проводить мультиплексные исследования, ускорять получение и анализ данных.

Высокая чувствительность

Mirrorball обеспечивает чувствительность проточного цитометра, потребляя меньше клеток и реагентов, позволяя экономить на обслуживании прибора. В отличии от проточной цитофлуориметрии позволяет детектировать малораспространенные антитела и белки, обладающие низкой аффинностью.

Простота применения

Простой протокол анализа «смешай и считывай» существенно упрощает исследования по разработке антител и скрининг клеточных препаратов, исключая трудозатратные стадии промывки на этапе пробоподготовки. Дружественное, интуитивно понятное программное обеспечение с предустановленными протоколами анализа идеально подходит для центров коллективного пользования.   

Широкая область применения 

Высокая чувствительность и возможности мультиплексного анализа идеально подходят для разработки антител, а также широкого круга применений для высокоинформативного анализа многоцветных изображений. Анализ в лунках позволяет работать как с адгезивными, так и с суспензионными клеточными культурами, облегчая пробоподготовку по сравнению с такими традиционными анализами, как проточная цитофлуориметрия и ИФА. 

 

 

Ниже представлены некоторые примеры применений этого уникального прибора:   

Скрининг воздействия активных молекул на биомишени  

Высокопроизводительный скрининг клонов В-клеток и антител 

Tickle и др. из UCB Pharma разработали эффективную методику скрининга антител к двум специфичным биомишеням. В данной работе высокопроизводительный скрининг культуры В-клеток проводился в комбинации с идентификацией и выделением единичных антиген-специфичных В-клеток, секретирующих антиген-специфичный IgG. Теперь скрининг более миллиона иммунных В-клеток на mirorball может стать успешным стартом для поиска редких терапевтических антител. 

Эффективные мультиплексные анализы с использованием микросфер (beads) и окрашенных клеток 

England и др. из Medimmune разработали высокочувствительный мультиплексный протокол для анализа кросс-реактивности и селективности антител для достаточно большого потока анализов. Здесь в одном мультиплексном эксперименте определялись как связывание 2 антител с клетками (2 разных красителя), так и количественное определение 3 цитокинов с помощью микросфер (beads) (с использованием одного красителя с разной интенсивностью). Данная работа демонстрирует возможность увеличения чувствительности и интенсивности скрининга для поиска биопрепаратов. 

Улучшение качества отбора антител при биологическом скрининге 

При поиске активных молекул к определенным биомишеням традиционными методами возникает проблема с ложно положительными результатами, когда «хорошо связывающиеся» молекулы связываются только с мертвыми клетками. mirrorball позволяет легко избежать этой проблемы, если анализ связывающихся антител с использованием микросфер (beads) сопровождается подсчетом общего числа клеток и числа мертвых клеток с использованием красителей. Конечные данные фиксируют только антитела, связавшихся с биомишенями на живых клетках. 

Повышение эффективности скрининга гибридом

Mirrorball дает возможность точно идентифицировать положительную и отрицательную активность связывания фрагментов, даже если образцы представляют собой сырые периплазматические экстракты. Для методик с использованием mirrorball требуется всего 1 час пробоподготовки без утомительных многостадийных протоколов с большим количеством промывок, как в случае с ИФА, без необходимости выделения фрагментов. 

Больше хитов при скрининге фаговым дисплеем

Mirrorball позволяет детектировать клетки, экспрессирующие весь целевой белок в его нативной конформации. При анализе традиционными неклеточными методами (ИФА) есть риски отказа от перспективных активных веществ вследствие получения ложно-отрицательных результатов. 

 

Характеристика связывания биологических объектов 

Кинетика связывания пептидов с клетками 

Благодаря тому, что mirrorball не требует стадий промывки, появляется возможность повторно в динамике смотреть кинетику связывания биотинилированных пептидов-лидеров фагового дисплея для определения относительной аффинности белков к клеткам, экспрессирующим целевые белки. Профили связывания согласуются с данными по аффинности, полученными другими методами. Если использовать белки с флуоресцентными тагами, появляется возможность определения величин Bmax и Kd. Mirrorball анализирует прикрепленные клетки in situ, появляется возможность получать более физиологически релевантные результаты. 

Замена традиционного ИФА-анализа

Традиционно растворимые белки (гормоны, цитокины) анализируют с помощью ИФА. Эта методика высокочувствительна, но включает большой объем промывок и инкубаций. Протокол сложно поддается автоматизации, а учитывая невозможность мультиплексности – определения нескольких параметров за один анализ, исследования еще больше утяжеляются рутинными операциями. Анализ белков домашнего хозяйства можно легко упростить, перейдя к протоколу с микросферами (beads) на приборе mirrorball. 

Функциональный анализ

Кроме изучения связывания молекул с биомишенями на клетках, исследователь получает возможность изучать влияние на фенотипические изменения клеток – клеточный цикл, апоптоз, пролиферация и цитотоксичность. 

 

Технические характеристики

Основное применение	Скрининг биологических мишеней для разработки фармацевтических препаратов
Технология детектирования	Лазерная сканирующая цитофлуориметрия
Возбуждающие лазеры	До 3 лазеров с длинами волн 405, 488 и 640 нм
Многоканальная детекция	Фотоэлектронный умножитель для одновременной детекции нескольких красителей
Детекция флуоресцентных красителей (до 5)	FL1 420-475 nm FL2 502-537 nm  FL3 565-605 nm FL4 667–685 nm  FL5 725-750 nm
Область сканирования	Лунка целиком (по умолчанию)
Общедоступный экспорт TIFF-файлов	Да, без влияния на скорость сканирования
Совместимость с планшетами	96-, 384- и 1536-луночный формат
Формат экспортируемых файлов	csv, fcs, tiff (8- и 16-бит)
Вес прибора	Около 60 кг
Габариты	645 мм х 513 мм х 350 мм
Энергопотребление	110/230 В, одна фаза, 47/63 Гц, 800 Вт

 

Время на сканирование и анализ образцов

Формат планшет	96-луночные	384-луночные	1536-луночные
Время анализа на планшету, мин (включает собственно сканирование и анализ данных)	12	12	12
Кол-во планшет за 24 часа работы	115	115	115
Кол-во образцов (лунок) за 24 часа работы	11 355	45 420	181 680
Объем данных за 24 часа работы	9 Мб	30 Мб	100 Мб

 

Технологии

Mirrorball – первый планшетный цитометр, который сочетает высокую чувствительность и отсутствие необходимости стадий промывки при пробоподготовке. 

Особенности:

• формат протокола анализа «смешай и читай»
• высокая способность к мультиплексности
• высокая чувствительность
• многофункциональность

 

 

Проточная цитофлуориметрия и mirorball 

 

 

Проточная цитофлуометрия	Mirrorball
При анализе адгезивных клеточных линий проточная цитофлуориметрия требует дополнительного шага для перевода их в суспензию. Часто это приводит к стрессу, и как следствие клетки собираются в комки, что в свою очередь приводит к забиванию каналов. Как результат – паузы в работе на промывку или даже ремонт оборудования.	Mirrorball позволяет скринировать как адгезивные, так и суспензионные клеточные линии in situ, и подобных ситуаций просто не возникает.
Традиционное мечение подразумевает многоступенчатые протоколы, включающие стадии промывок и требующие много времени и расхода реагентов.	Протокол для анализа на mirrorball намного проще – надо только добавить реагенты, считать планшету и получить свои результаты.
В автоматизированном проточнике образцы, разделенные пузырьками воздуха, подаются непрерывным потоком. Нарушение этих пустот может привести к нарушению целостности образца и ошибке идентификации.	Целостность образца – ключевой момент аналитики. В mirrorball целостность образца гарантирована, т.к. каждый образец анализируется in situ.
В автоматизированном проточнике каждый образец после прочтения уходит в слив, и анализ изменений во времени невозможен.	Методика анализа в mirrorball не деструктивна, анализ изменений во времени легко осуществим - требуется всего лишь повторно сканировать образец через определенный промежуток времени.
Данные анализа в проточной цитофлуориметрии выдаются в виде диаграмм рассеяния, без визуализации клеток.	Mirrorball по требованию может сохранять фотографии в формате tiff, это дает дополнительную визуализацию результатов, что повышает уверенность в корректности анализа.
Анализ на проточном цитофлуориметре требует достаточно большого объема клеток (обычно до 200 000 на анализ).	Микропланшетная цитометрия требует значительно меньшего количества клеток (до 2 000 на планшету). Иногда это может быть критически важным вследствие недостатка релевантного биологического материала.

 

Иммуноферментный анализ и mirrorball

 

 

 

Иммуноферментный анализ	Mirrorball
Для ИФА необходимы растворимые фрагменты белков или выделенные антигены, а не клетка. Этот формат менее биологически релевантный по сравнению с клеточными анализами.	Mirrorball скринирует интактные клетки, позволяя анализировать антигены в их нативной конформации и сохраняя целевые эпитопы. Использование нативных антигенов уже на ранних этапах скрининга позволяет избежать ложно положительный результатов и поможет идентифицировать настоящих лидеров, которые ИФА может по ошибке отклонить.
Получение растворимых фрагментов белков или выделенных антигенов достаточно трудозатратный процесс, который требует очень сложную автоматизированную платформу.	Mirrorball использует клетки, которые экспрессируют биомишени, и исследователю нет необходимости выделять белки.
Протокол ИФА включает около 15 стадий промывки.	Протокол ИФА легко конвертировать в протокол с микросферами, который не требует стадий промывок и существенно повышает эффективность работы лаборатории
В результате многочисленных промывок, требующихся при проведении ИФА, легко потерять биопрепараты с низкой аффинностью.	Скрининг на mirrorball позволяет работать с биопрепаратами с низкой аффинностью.
При проведении ИФА только одна биомишень может присоединиться, что не допускает проведения мультиплексных анализов.	Mirrorball представляет собой мультиплексную систему с 3 лазерами и 5 каналами для сбора сигнала. Это позволяет комбинировать несколько анализов в один и получать нужные для принятия решений данные быстрее и с меньшими затратами.